“也就是Cathepsin X調控小膠質細胞功能的特異性驗證問題。這裡麵的麻煩事，簡直多到能寫一本書！”
說到這裡，她像是開啟了話匣子，語速越來越快：
“比如，Cathepsin家族裡，跟它功能相似的還有Cathepsin B、L等等，它們的功能存在重疊。”
“我們用抑製劑抑製了Cathepsin X之後，很有可能會出現其他家族成員的代償效應，就是說彆的蛋白酶跑出來‘替班’了，這樣一來，就直接乾擾了我們的實驗結論！”
“另外，小膠質細胞的啟用和吞噬功能，本身就受到多個訊號通路的共同調控，像什麼TLR4通路等等。”
“我們現在根本分不清楚，我們研究的這個Cathepsin X，到底是處在訊號通路最上遊的那個‘總開關’，還是僅僅隻是下遊的一個‘小兵’！”
“更彆提到了體內實驗，也就是在小鼠身上做實驗的時候，如果我們把Cathepsin X的基因給敲除了，小鼠自身為了活命，會出現代償性的生理變化，比如其他蛋白酶的表達量莫名其妙地上調了，這些變化，很可能會把Cathepsin X真實的作用機製給完全掩蓋掉！”
林穎幾乎是一口氣，喋喋不休地說了一大堆極其專業的術語和實驗困境。
說到最後，她停了下來，看著一臉平靜的周鉑，眼神裡帶著幾分明顯的試探。
然後她懷疑得問了一句：“我剛剛說的，你聽懂了嗎？”
說完之後，林穎自己都有些泄氣了。
這些難題，連她的博導都感到頭疼，也隻是給了個大方向，讓他們團隊自己去摸索、去嘗試。
她現在跟一個高二的學生說這些，又能有什麼用呢？
無非就是找個人傾訴一下罷了。
“哎蒜鳥蒜鳥。”林穎歎氣。
然而，周鉑聽完她這一長串的抱怨之後，卻依舊是一臉的平靜，甚至還在腦海裡快速地將這些問題點進行了梳理和歸類。
他這些年，為了給自己未來的腦機介麵和意識上傳實驗打基礎，啃了大量的神經科學、分子生物學相關的專業書籍，甚至還通過特殊渠道，聽過不少海外頂尖大學的前沿課程錄影，也自己做過無數次的理論研究和方案推演。
林穎說的這些問題，在彆人看來或許是天塹，但在他這裡，還真的……有點頭緒。
周鉑清了清嗓子，緩緩開口道：
“好了，大姐，你的問題我大概都聽明白了。我們一個一個來解決。”
“先說說你那個第一個難題，原代小膠質細胞的高純度分離培養。這個問題，其實是很多神經實驗室的老大難問題。我的建議有四點，你可以記一下。”
“第一，優化你們的分離流程。我建議采用‘胰酶冷消化’加‘機械吹打’相結合的方式。”
“具體來說，就是用0.25%的胰酶，在4℃的低溫環境下，消化15分鐘左右，然後立即用終止液終止消化。”
“接著，用不同口徑的巴氏吸管，進行輕柔的梯度吹打，切記，一定要避免產生氣泡和強力吹打，那樣會直接造成細胞的大量死亡。”
“最後，過一個70微米的細胞篩網，去除那些冇消化開的細胞團塊。”
“第二，在分離方法上，你們可以采用‘差速貼壁法’進行初步提純，然後再結合‘震盪提純法’來進一步強化純度，把那些貼壁不牢的雜細胞給震下來。”
“第三，也是最關鍵的，優化你們的培養基配方。我建議，采用含有10%優質胎牛血清，並額外新增20ng\\/mL濃度的M-CSF，也就是巨噬細胞集落刺激因子的DMEM\\/F12培養基。”
“M-CSF這個細胞因子，能夠特異性地促進小膠質細胞的增殖，同時，還能在一定程度上，抑製星形膠質細胞的過度生長。此消彼長之下，純度自然就上去了。”
“至於你說的第二個難點，MCAO動物模型，你說自己能搞定，靠標準化手術操作來解決，這個思路是對的，我就不多說了。”
“現在，我們重點說說你那個最頭疼的第三個難點——Cathepsin X調控小膠質細胞功能的特異性驗證問題。這個問題確實複雜，但也不是無解。我的建議，主要有三點。”
“第一，采用‘特異性抑製劑’加‘基因敲除’雙重驗證的策略。”
“也就是說，在你的體外細胞實驗中，要同時設定‘特異性抑製劑處理組’和‘shRNA基因敲除組’，而且，還要額外增設一個‘非特異性抑製劑’的對照組。”
“通過Western Blot（蛋白質印跡法）技術，來檢測Cathepsin家族各個主要成員的蛋白表達水平，這樣就能直觀地看到，是否存在其他家族成員的代償效應乾擾。”
“第二，關於訊號通路上下遊的定位驗證。這個可以藉助‘免疫共沉澱（Co-IP）’技術，來篩選Cathepsin X在細胞內的互作蛋白，找到它的‘朋友’。”
“然後再結合‘RNA乾擾’技術，把這些‘朋友’一個個沉默掉，看看會對下遊產生什麼影響。”
“通過這種方式，就能明確它在整個訊號通路中的具體定位，判斷它到底是上遊的‘總司令’，還是下遊的‘小兵’。”
“第三，關於吞噬功能的特異性檢測。我建議你們采用不同的吞噬底物，比如你剛纔提到的，熒遊標記的凋亡神經元碎片，和惰性的熒光乳膠微球。”
“同時，利用流式細胞術或者免疫熒光，去檢測吞噬相關的關鍵蛋白，比如CD68的表達量，以及細胞膜電位的變化。”
“通過多維度的資料，來綜合區分Cathepsin X對小膠質細胞吞噬功能的，到底是特異性的，還是非特異性的調控作用。”
周鉑幾乎是一口氣，條理清晰、邏輯嚴謹地將這一整套優化方案給說了出來。
說完之後，他才放緩了語氣，看著已經完全呆若木雞的林穎，補充道：“大姐，你先彆急著消化。”
“這些東西光靠嘴說可能有點抽象，明天……不，等我有空了，我把整理好的詳細優化流程和實驗步驟，發給你。”